福岡農総試研報

発生培地中のグルコース，アミノ酸及び浸透圧が
牛体外受精胚の発育に及ぼす影響

上田修二・平嶋善典

（畜産研究所）

　卵丘細胞との共培養条件下で体外受精後の牛胚を培養する際，TCM199培地のグルコース，アミノ酸及び浸透圧が胚の発育に及ぼす影響について検討した。その結果，1.培地中のエネルギー源の有無，種類に関わらず，胚は 8細胞期胚まで発育したが，胚盤胞まで発育させるには培地中にグルコースが含まれている必要があった。培地からグルコースを除き，乳酸とピルビン酸ナトリウムを加えても培養初期の発育率は向上しなかった。2.媒精後 120時間までに，発生培地にグルコースが含まれれば発育率に差は認められなかった。また，濃度は本来含まれている濃度（5.56mM）か，その 1/2の濃度が適していた。3.TCM199中のアミノ酸の有無は，胚盤胞率及び脱出胚盤胞率に影響を及ぼし，特に必須アミノ酸が胚の透明帯からの脱出に関与していることが示唆された。4.TCM199の無機塩類濃度を低くし，浸透圧を 270mOsmに下げることにより，胚盤胞率及び脱出胚盤胞率が向上した。また，低浸透圧(270mOsm) のTCM199で作出した拡張胚盤胞の細胞数は，従来のTCM199で培養した場合に比べて約30％増加し，体内受精胚の細胞数と同程度になった。

［キーワード：体外受精，牛胚，グルコース，アミノ酸，浸透圧］

　　　　　Effects of Glucose,Amino Acids and Osmolarity on Development of In Vitro Fertilized Bovine Oocytes in Culture Medium..UEDA Shuji and Yoshinori HIRASHIMA (Fukuoka Agricultural Research Center, Chikushino, Fukuoka 818, Japan) Bull. Fukuoka Agric. Res. Cent.16: 100-104 (1997)
　　　　　In the first experiment, we studied the effects of glucose, pyruvate and lactate using TCM199 medium on embryo development. Many embryos developed to 8-cell in the presence or absence of glucose, pyruvate and lactate, whereas the blastocyst stage required the glucose to develop. When glucose was added from 3 to 120 hours post-insemination, the rates of blastocyst were higher compared with no glucose. Addtion of 2.78 or 5.56 mM glucose improved development to the 9 blastcyst stage, compared with no glucose and 11.12 mM glucose.
　　　　　In the second experiment, we studied the effects of amino acids and osmolarity on embryo development. Presence of essential amino acids (EAA) or EAA + non-essential amino acids (nEAA) improved development of the blastocyst and hatched-blastocyst stages, compared with absence of all amino acids or presence of nEAA only. When the osmolarity of TCM199 was adjusted to 270 mOsm, the rate of blastocyst and hatched-blastocyst were higher than the control (300 mOsm) and 150 mOsm. The total cell numbers of embryos cultured in TCM199 adjusted to 270mOsm were significantly different from these in TCM199 at expanded blastocyst stage.

［Key Words: In vitro fertilization, Bovine embryo, Glucose, Amino acids, Osmolarity］

緒　　言

　と畜卵巣を活用した牛体外受精胚移植による子牛生産の成功９）以来，牛の体外受精技術は実用化技術として着実に進んできた。胚の体外培養においては，卵丘細胞との共培養５）１２）だけでなく，卵管上皮細胞などとの共培養４）も可能となり，さらに，培地にβメルカプトエタノールを添加すると，共培養することなく胚盤胞まで発育させられることが明らかになった８）。発生培地としては，CR1aa１４），SOF１６）やHECM１５）などの有効性も明らかになってきたが，発育率がやや劣ることなどから，現在も血清を添加したTCM199による共培養法１２）が多く用いられている。しかし，1)TCM199に含まれているグルコースは培養初期の胚の発育を阻害する１３）こと，2)発生培地中のアミノ酸は胚の発育に関与している１５）が，TCM199ではアミノ酸の胚の発育に及ぼす効果が明らかでないこと，3)胚の培養には培地の浸透圧は270〜280mOsmが適している３）が，TCM199は浸透圧が 300mOsm前後であることなど，TCM199を用いた培養法には依然検討の余地がある。
　そこで，まず，グルコースを除いたTCM199を供試して，胚の発育率に対するエネルギー源の影響，特にグルコースの添加時期と添加濃度について検討した。次に，アミノ酸を除いたTCM199を供試して，アミノ酸が胚の発育に及ぼす効果を検討するとともに，TCM199の無機塩類の濃度を調整することによって，浸透圧が胚の発育に及ぼす影響を検討した。さらに，浸透圧を270mOsmに下げたTCM199で発育した胚の細胞数を従来のTCM199(300mOsm)で発育した胚の細胞数と比較した。

材料及び方法

　1　卵子の採取及び体外成熟
　卵巣は食肉処理場において，と畜された黒毛和種雌から回収し，30℃に保温したペニシリン200IU/ml，ストレプトマイシン200μg/ml添加リンゲル液に集めた。回収した卵巣を保存液で洗浄した後，卵巣表面の 10mm以下の小卵胞から注射器で吸引した卵胞液を試験管に集めた。実体顕微鏡下で，試験管の沈殿部から卵丘細胞が緊密に数層以上に付着している卵子を選別し，TCM199(ギブコ;380-2340)に5%子牛血清(CS)，ペニシリン100IU/ml，ストレプトマイシン100μg/mlを添加した成熟培地に移した。卵子は，新しい成熟培地で 2度洗浄後，ミネラルオイル下の成熟培地に移し， 3ガス培養器で20〜24時間培養した。
　なお，卵子の体外成熟から体外発生までは，3ガス培養器内において10%O２, 3%CO２, 87%N２，38.5℃の条件下で行った。

　2　精子の受精能獲得及び体外受精
　融解した黒毛和種の凍結精液を 5mMテオフィリンと5mMカフェインを添加したBrackett&Oliphant(BO)液で希釈し，2500rpm, 5分間で 2回遠心分離後，精子濃度を20×10６/mlに調整した。この精子液を20mg牛血清アルブミン/ml添加BO液で 2倍希釈し，最終精子濃度を10×10６/mlとした。最終精子懸濁液で200μｌのドロップを作成し，表面をミネラル液で覆った後，3ガス培養器内に静置した。この精子液に，成熟培養を終えた卵子を移し 3時間培養した。

　3　胚の体外培養
　実験1-1　発生培地におけるエネルギー源の種類の影響
　エネルギー源の影響を解明するために，グルコース(G)を除去したTCM199(三光純薬；G欠TCM199)に，乳酸(5mM；L)，ピルビン酸ナトリウム(0.4mM；P)，グルコース(　　5.56mM)をそれぞれ単独で，あるいは乳酸とピルビン酸ナトリウムの組み合わせで添加した培地を作成した。これらのエネルギー源を加えた培地に，CSを10%とペニシリン100IU/ml，ストレプトマイシン100μg/mlを加えた。以下の実験も各々調整した培地に，CSとペニシリン，ストレプトマイシンを同様に加えた。
　媒精後の卵子は，それぞれエネルギー源を加えた発生培地で洗浄し，体外培養を行った。媒精48時間後に培地を交換した後，ピペッティングで卵子に付着した卵丘細胞を除去し，分割状況を検査した。媒精7〜9日目に胚盤胞期以上に発育した胚を検査した。
　実験1-2　発生培地に添加するグルコースの添加時期の影響
　グルコースの適正な添加時期を明らかにするために，媒精を終えた卵子は10%CS添加G欠TCM199で培養し，媒精 3, 48, 72, 96, 120時間後にG欠TCM199にグルコースを5.56mM添加した培地に移して培養を継続した。
　実験1-3　発生培地に添加するグルコース濃度の影響
　グルコースの適正な添加濃度を明らかにするため，媒精を終えた卵子はグルコースを0, 2.28, 5.56,11.12mMと10%CSを添加した培地に移し，体外培養を行った。
　実験2-1　発生培地におけるアミノ酸の効果
　TCM199の組成から，アミノ酸，ビタミン及びグルコースを除いたTCM199(三光純薬；AVG欠TCM199)にBME(Basal Medium Eagle)　必須アミノ酸溶液(ギブコ；EAA，EAA区)，MEM(Mninimum Essential Medium)非必須アミノ酸溶液（ギブコ；nEAA，nEAA区），EAA+nEAA(EAA+nEAA区)を1％加え，さらにMEMビタミン溶液(Vit)を1％とグルコースを5.56mM加えた培地を作成し，媒精後の卵子を培養した。媒精7〜9日目の胚盤胞，媒精11日目までの脱出胚盤胞を計数した。
　実験2-2　発生培地の浸透圧の影響
　浸透圧を下げるために，AVG欠TCM199を超純水で，1.1，1.25， 2倍に希釈した後，EAA，nEAA，Vitを1％とグルコースを5.56mM加えた。希釈後の浸透圧は，各々270，240， 150mOsmとした。なお，希釈しなかった培地の浸透圧は 300mOsmである。媒精後の卵子をこれらの発生培地に移し，胚盤胞及び脱出胚盤胞への発育状況を調査した。各実験は３回反復し，発育率はχ２検定を用いて比較した。
　実験2-3 　修正199が拡張胚盤胞の細胞数に及ぼす影響
　AVG欠TCM199を超純水で1.1倍に希釈し，EAA，nEAA，Vitをそれぞれ1%添加した区に，グルコースを5.56mM，CSを10%添加した修正199(270mOsm)とTCM199(ギブコ)にCSを10%添加した培地によって，媒精9日目に発育した拡張胚盤胞をヘキスト33342で染色した。蛍光顕微鏡で青く染まった核を計数し，細胞数とした。細胞数はt-検定で比較検討した。

結　果

実験1-1　発生培地おけるエネルギー源の種類の影響(第1表)
　媒精48時間後の分割胚率は，TCM199にエネルギー源を添加しなかった区の72.1%に対して，添加区は72.6〜86.4%と差がなかった。また，8細胞期胚率においても，無添加区の24.6%は，添加区28.6〜35.6%と差がなかった。
　胚盤胞率は，無添加区では0%であり，またL区，P区，L+P区も1.4〜8.9%と低率であった。G区は27.4%と無添加区と他の添加区に対して高かった。　


実験1-2　発生培地に添加するグルコース添加時期の影響(第2表)
　媒精48時間後の分割検査時には，まだグルコースが培地に添加されていないため48〜 120時間区及び無添加区のデータをまとめると，分割胚率と 8細胞期胚率は，各々 76.9%(320/416)， 28.4%(118/416)となった。一方，媒精後最初からグルコースを添加したTCM199で培養した 3時間区の分割胚率と 8細胞期胚率は，各々72.4%，38.1%であり，前者と差がなかった。
　胚盤胞率は，無添加区の3.4%に対して，添加区は17.9〜29.5%と高かったが，添加時期間では一定の傾向は認められなかった。　


実験1-3　発生培地に添加するグルコース濃度の影響(第3表) 　
　分割胚率は，無添加区の88.1%に対して，各添加区は74.3〜86.2%と差がなく，一定の傾向は認められなかった。8細胞率も，無添加区の40.7%に対して，39.4〜51.4%と差はなく，一定の傾向も認められなかった。
　胚盤胞率は，無添加区の0%に対し，2.28及び5.56mMは各々18.5,17.1%と高かったが，11.12mM区は差がなく，また，2.28と5.56mM区の間には差はなかった。　


実験2-1　発生培地におけるアミノ酸の影響(第4表)
　分割胚率において，アミノ酸無添加区72.5%に対して，EAA区は70.6%，nEAA区は68.6%，EAA+nEAA区は74.8%と差がなかった。8細胞期胚率においても，同様な結果であった。胚盤胞率において，無添加区の12.7%に対して，EAA区は19.3%とnEAA区は7.6%と差がなかったが，EAA+nEAA区は28.0%と高かった。また，EAA+nEAA区は，nEAA区に対しても高かった。脱出胚盤胞率においては，無添加区2.0%及びnEAA区1.9%に対して，EAA区の13.8%及びEAA+nEAA区の19.6%は高かった。　

実験2-2　発生培地の浸透圧の影響(第5表)　　
分割胚率及び 8細胞胚率において， 300mOsm区(72.4%,30.3%)に対して，270(81.6%,44.7%)及び240mOsm(80.9%,36.8%)区は差がなく，150mOsm区は10.3%,0%と顕著に低率であった。
　胚盤胞率において，無希釈区15.8%に対して，270mOsm及び240mOsm区は各々39.5%，30.9%と高かった。脱出胚盤胞率においても同様な傾向が認められ，270mOsm及び240mOsm区は各々35.5%，30.9%と無希釈区10.5%に比べて高かった。　


実験2-3　修正199が細胞数に及ぼす影響（第6表）
　TCM199で発育した拡張胚盤胞の細胞数が116〜171個の範囲で，平均値は137.2±16.1個であったのに対して，修正199で発育した拡張胚盤胞の細胞数は131〜232個の範囲で，平均値は177.0±33.3個と増加した。

考　察

　乳酸とピルビン酸は，マウス胚では体外培養の初期段階で胚の発生を促進し２　），牛胚でも両者の添加が必要であるとの報告１３）があるが，本実験では両者を培地に加えても発育率は向上しなかった。これは，動物種によって必要とするエネルギー源が異なることと，培養条件（共培養と非共培養）が異なることが原因と考えられる。エネルギーの代謝経路が牛胚に近い羊胚は，培養初期はピルビン酸を必要とするが，グルコースをほとんど利用せず，ピルビン酸は胚盤胞以降，グルコースは16細胞以降に急激に消費する６）。本実験で用いた牛胚では，8細胞期までは培地中のエネルギー源を必要としないが，それ以後胚盤胞まで発育するにはグルコースが必要であることが明らかになった。
　KIM et al１３）は，グルコースが媒精96時間後までに培地に含まれると胚の発育が阻害され，120時間以降になるとグルコースが必要であると報告している。これに対して，TCM199のグルコース添加時期を検討した結果，媒精48時間後の分割胚率及び８細胞期胚率に差は認められず，胚盤胞率も，無添加区に対して高かったが，添加時期による差は認められなかった。このことは，本実験で行われた共培養では，培養初期において卵丘細胞がグルコースの一部を消費した６）ことから，胚の発育が阻害されなかったものと考えられる。
　本実験の条件では，胚盤胞率からみて，グルコース濃度は2.78〜5.56mMが適当と思われ，11.12mMのグルコース添加は，８細胞以降の発育を明らかに阻害した。これは，KIM et al１３）１６）も，2.78〜5.56mMのグルコース濃度が胚の発育に適していると報告しており一致する。これらのことから，TCM199を基礎培地とした共培養では，エネルギー源としてグルコースが不可欠であり，グルコースは媒精120時間までに発生培地に含まれること，濃度は2.78〜5.56mMが適すると考えられる。
　TCM199は，必須アミノ酸と非必須アミノ酸を組成として含んでいるが，本実験の結果から必須アミノ酸の効果が大きいことが明らかになった。修正SOF培地においても，アミノ酸は胚の発育と細胞数の増加に効果があることが認められている１６）。しかし，アミノ酸の添加の有無が媒精48時間後までの発育率に影響しなかったことから，エネルギー源と同様に，８細胞以降に積極的に利用されるものと考えられる。培地に必須アミノ酸を含むと，透明帯から脱出する胚の割合が増加する傾向にあり(15.3-25%→70-71.4%)，必須アミノ酸のいずれかの成分が透明帯脱出に関与していることが推察される。
　牛子宮液の浸透圧は280mOsm前後とされており，胚の培養には270〜280mOsmが適当と報告３）されている。BECKMANN and DAY１）　は，mWM(280.50mOsm)の浸透圧を約50mOsm上げると発育率が低下し，mKRB(339.75mOsm)の浸透圧を約50mOsm下げると発育率が改善されたことを報告している。本実験おいてもTCM199の塩類濃度を下げ，浸透圧を10〜20%低下させることにより，胚盤胞及び脱出胚盤胞への発育率が大幅に改善された。従来のTCM199の浸透圧は300mOsmと高いので，その塩類濃度を下げ，270〜240mOsmと適正な浸透圧に調整することによって，本来胚が持つ発育能が阻害されることはないと考えられる。
　IWASAKI and NAKAHARA１０）は，胚の活性評価には，形態的評価より胚の細胞数が重要であると報告している。また，発情7,　8日目に採取した体内受精胚の初期胚盤胞から拡張胚盤胞の細胞数は，100〜160個であり，10%CS添加TCM199で卵丘細胞と共培養した場合，細胞数は141.4±49.2と報告されている１６）。本実験において，270mOsmに調整したTCM199(修正199)で発育した拡張胚盤胞の細胞数は177.0±33.3と，従来のTCM199(300mOsm)で発育した胚の細胞数(137±16.1)より増加し，体内受精胚と比較して同程度の細胞数であった。
　これらのことから，発生培地としてのTCM199の浸透圧を270mOsm程度に調整することにより，移植可能な胚（胚盤胞）を多量に生産できるとともに，より品質の高い胚の生産が可能になると考えられる。

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